视黄醇和β-胡萝卜素的换算公式为：视黄醇=β-胡萝卜素/2

硫胺素和盐酸硫胺素的换算公式为：硫胺素=盐酸硫胺素/1.121

吡哆醇和盐酸吡哆醇的换算公式为：吡哆醇=盐酸吡哆醇/1.215

1叶酸的测定

1.1检验依据

本方法参考《中华人民共和国药典》（2015年版二部）“叶酸”规定的方法检测。

1.2 原理

试样中的叶酸用弱碱液稀释提取，采用高效液相色谱仪分离检测，紫外检测，外标法定量。

1.3 试剂或溶液

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

1.3.1 0.5% 氨水溶液。

1.3.2 0.5 mol/L四丁基氢氧化铵甲醇溶液。

1.3.3 1 mol/L 磷酸溶液。

1.3.4 磷酸盐缓冲液（pH 5.0）：取磷酸二氢钾2.0g，加水约650ml溶解，加0.5 mol/L四丁基氢氧化铵甲醇溶液15mL、1mol/L磷酸溶液7mL与甲醇270mL，放冷，用1mol/L磷酸溶液或氨试液调节pH值至5.0，用水稀释至1000mL。

1.3.5 叶酸标准品：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

1.3.6 叶酸标准储备液：准确称取0.05g（精确到0.0001g）叶酸标准品于100mL棕色容量瓶中，加入0.5%氨水溶液，超声使其溶解，稀释定容至刻度，摇匀。此标准储备液中叶酸含量为500μg/mL。

1.3.7 叶酸标准工作液：根据样品中叶酸的大致含量调整稀释倍数，使标准工作液中叶酸的浓度约为1.0～8.0 μg/mL，用0.5%氨水溶液稀释定容。当日制备并使用。

1.4 仪器和设备

1.4.1 天平：感量0.0001g。

1.4.2 超声波水浴。

1.4.3 高效液相色谱仪：带紫外检测器。

1.5 试验步骤

1.5.1 试样的准备

液体试样需要提前充分混合均匀。

准确称取8g（精确至0.01 g）的试样，置于50mL棕色容量瓶中，加入30mL 0.5%氨水溶液，调pH值约9.0，常温超声提取15min，用水定容至刻度线，摇匀，过膜（0.45μm）待上机测定。

1.5.2 参考色谱条件

色谱柱：C18柱，长250mm，内径4.6mm，粒度5μm，或性能相当者。

流动相：磷酸盐缓冲液（pH 5.0）

流速：1.2mL/min。

温度：室温。

检测波长：280nm。

进样量：10μL。

1.5.3 试验数据处理

       试样中叶酸的含量，以微克每百克（μg/100g）表示，按式（1）计算：

X = c / m ×V ×100…………………………………………（1）

式中：

X——试样中叶酸的含量，μg /100g；

c——由标准曲线得出的样品溶液中叶酸的浓度，μg/mL；

V——样品稀释定容体积，mL；

m——试样称取的质量，g。

测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。

2 生物素的测定

2.1检验依据

本方法参考《保健食品中9种水溶性维生素的测定》（BJS 201716）（国家食品药品监督管理总局公告 2017年第160号）中生物素规定的方法检测。

2.2 原理

试样采用液相色谱-串联质谱仪检测，外标法定量。

2.3试剂和材料

注：除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

2.3.1 试剂

2.3.1.1甲醇：质谱级。

2.3.1.2甲酸：质谱级。

2.3.1.3氨水：含量26%。

2.3.1.4冰醋酸。

2.3.1.5 浓盐酸。

2.3.1.6氨水（1+5）：量取100 mL 氨水（2.3.1.3）缓慢倒入500 mL 水中，混匀。

2.3.1.7 盐酸（0.01 mol/L）：吸取9 mL 浓盐酸（2.3.1.5），溶于1000 mL 水中。吸取该溶液50 mL，用水稀释并定容至500 mL。

2.3.1.8 0.1%甲酸水溶液：取甲酸1 mL用水稀释至1 000 mL，用滤膜（2.3.4）过滤后备用。

2.3.1.9 0.1%甲酸甲醇溶液：取甲酸1 mL用甲醇稀释至1000mL，用滤膜（2.3.4）过滤后备用。

2.3.2标准品

生物素（Biotin），CAS：58-85-5；分子式：C10H16N2O3S；分子量：244.30，纯度≥98%。

2.3.3标准溶液配制

2.3.3.1生物素标准储备液（1 mg/mL）：称取生物素标准品（2.3.2）0.1 g（精确至0.0001 g），加入30 mL氨水（2.3.1.6）溶解，甲酸调节pH值至7.0后，用水转移并定容至100 mL棕色容量瓶中。

2.3.3.2 空白基质溶液的配制：取空白试样按照试样制备方法（2.5.2）操作。

2.3.3.3基质标准工作液：准确吸取生物素标准储备液（2.3.3.1）适量，用空白基质溶液将其稀释成含量分别为0.01 µg/mL、0.05 µg/mL、0.1 µg/mL、0.5 µg/mL、1 µg/mL的基质混合标准工作液。

注：操作过程应在避光环境下进行。

2.3.4微孔滤膜：0.22 µm，有机相。

2.4仪器和设备

2.4.1 高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。

2.4.2 超声波清洗器。

2.4.3 分析天平：感量分别为0.01 g和0.000 1 g。

2.5 分析步骤

2.5.1试样制备

将液体试样混合均匀。

2.5.2试样提取

准确称取混合均匀的试样10g（精确至0.01 g）于50 mL棕色容量瓶中，加入30mL水，超声10 min，冷却至室温，用水定容至刻度，摇匀，上清液经微孔滤膜（2.3.4）过滤，供液相色谱-串联质谱仪测定。

注：操作过程应在避光环境下进行。

2.5.3 仪器参考条件

2.5.3.1 色谱条件

a）色谱柱： HSS T3柱，1.8 μm，100 mm×2.1 mm（内径），或性能相当者；

b）流动相：A为0.1%甲酸水溶液（2.3.1.8），B为0.1%甲酸甲醇溶液（2.3.1.9），洗脱梯度见表2.1；

c）流速：0.3 mL/min；

d）柱温：30℃；

e）进样量：2 μL。

表2.1 洗脱梯度

2.5.3.2 质谱条件

a）电离方式：电喷雾正离子模式。

b）检测方式：多反应检测（MRM）。

c）雾化气压力：45psi。

d）离子喷雾电压：3500V。

e）干燥气温度：300℃。

f）干燥气流速：5 L/min。

g）定性离子对、定量离子、碎裂电压和碰撞能量见表2.2。

表2.2 水溶性维生素的定性离子对、定量离子、碎裂电压和碰撞能量

* ：定量离子

2.5.4 定性测定

按照上述条件测定试样和混合标准工作液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与混合标准工作液中的某种组分一致（变化范围在±2.5%之内）；试样中定性离子对的相对丰度与浓度相当混合标准工作液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表2.3规定的范围，则可判定为试样中存在该组分。

表2.3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

2.5.5 定量测定

2.5.5.1 标准曲线的制作

    将基质标准工作液（2.3.3.3）分别按仪器参考条件（2.5.3）进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积。以基质标准工作液的浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2.5.5.2 试样溶液的测定

    将试样溶液（2.5.2）按仪器参考条件（2.5.3）进行测定，得到相应的样品溶液的色谱峰面积。根据标准曲线得到待测液中组分的浓度，平行测定次数不少于两次；试样待测液响应值若低于标准曲线线性范围，应取2.5.2中试样提取续滤液进行分析；试样待测液响应值若超出标准曲线线性范围，应用水稀释后进行分析。

2.6结果计算

结果按式（1）计算：

X = c / m ×V × 100…………………………………………（1）

式中：

X—试样中生物素的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；

c—由标准曲线得出的样液中生物素的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

V—试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）；

m—试样称取的质量，单位为克（g）；

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

3 胆碱的测定

3.1 检验依据

本方法根据《高效液相色谱-蒸发光散射检测器联用法测定婴幼儿配方乳粉中胆碱的含量》（刘雪梅等(2016)，中国食品卫生杂志），对保健食品中胆碱含量的检测加以规范。

3.2 检验原理

因胆碱不具备吸收紫外光的生色团，因此通过高效液相色谱（HPLC）分离后，采用蒸发光散射检测器（ELSD）进行检测。

3.3 试剂和材料

   警告-应当严格遵循有毒物质使用规程。采取有效措施保证组织、个人安全。

以下所用试剂，除特别注明外，均使用色谱纯试剂

3.3.1试剂

3.1.3.1三乙胺

3.1.3.2乙腈

3.1.3.3超纯水

3.1.3.4 冰醋酸

3.3.2 标准品

重酒石酸胆碱，USP级标准物质（1133536，SIGMA）

3.3.3标准溶液配制

3.3.3.1重酒石酸胆碱标准储备溶液：将重酒石酸胆碱标准品置于105℃烘箱中加热3h至质量恒定；快速并准确称取0.15g重酒石酸胆碱的标准品于50mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容，配成浓度为3.0mg/mL的重酒石酸胆碱储备溶液。

3.3.3.2重酒石酸胆碱标准使用溶液：用超纯水对重酒石酸胆碱储备液进行梯度稀释，配制成不同浓度的标准使用溶液。

3.4仪器和设备

3.4.1高效液相色谱仪（附梯度系统和蒸发光散射检测器）。

3.4.2分析天平，分度值0.0001g

3.4.3过滤器，用于过滤外标和测试样品溶液，例如：Millex HV

3.4.4恒温鼓气式烘箱

3.5 分析步骤

3.5.1试样制备

将液体试样混合均匀。

精密量取0.5g（精确至0.01 g）的样品，置于100mL的容量瓶中，用超纯水充分溶解后定容，用0.22μm孔径滤膜过滤后得到样品供试液，待上机检测。

3.5.2色谱条件

3.5.2.1色谱柱：Agilent ZORBAX 300-SCX阳离子交换柱 4.6mm×250mm，5μm。

3.5.2.2流动相：A：30mmoL/L三乙胺水溶液用冰醋酸调节至pH=6；B：乙腈。A:B=80:20（V/V）。

3.5.2.3柱温箱温度：可调至35℃。

3.5.2.4流速：1.0 mL/min。

3.5.2.5检测器：蒸发光散射检测器

3.5.2.6雾化气：氮气

3.5.2.7检测器压力：310kPa

3.5.2.8漂移管温度：40℃

3.5.2.9增益值：8

3.5.3测定

取测试溶液和标准使用液20µL（或相同体积）注入高效液相色谱仪进行分离，以其标准溶液的保留时间为依据进行定性，以其峰面积求出样液中被测物质的含量，供计算。

3.5.4结果计算

用标准曲线计算重酒石酸胆碱的含量。按式（1）计算样品中胆碱的含量

       X=(c × V) / (m × 2.09 × 10)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1)

式中：

X——样品中胆碱的含量，mg/100g；

c——测试样品溶液中重酒石酸胆碱的浓度，μg/mL；

V——样品稀释后的定容体积，mL；

m——试样称取的质量，g；

2.09——重酒石酸胆碱换算成胆碱的换算系数；

计算结果保留至小数点后二位。

4维生素C的测定

4.1检验依据

本方法参考《保健食品中功效成分的检测方法》（2011年版 白鸿主编）中“维生素C的高效液相色谱测定法”规定的方法检测。

4.2 原理

试样用草酸提取后采用高效液相色谱-紫外检测器检测。

4.3试剂和材料

注：除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

4.3.1 0.1%草酸（AR）溶液（w/v）；

4.3.2 L-抗坏血酸标准品(C₆H₈O₆)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

4.3.3 L-抗坏血酸标准储备液（1.0mg/mL）：精密称取L-抗坏血酸标准品0.100g，置于100mL棕色容量瓶中，用0.1%草酸溶解并稀释至刻度；

4.3.4 L-抗坏血酸标准系列工作液：分别吸取0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL L-抗坏血酸标准储备液，分别置于10mL棕色容量瓶中，用0.1%草酸稀释至刻度，配制成20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL的标准使用液。

4.4 操作步骤

4.4.1 样品处理

充分摇匀的液体样品，精密称取1.000g，置于50mL棕色容量瓶中，用0.1%草酸稀释至刻度线，经0.45μm微孔滤膜过滤后进样测定。

4.4.2 标准曲线的绘制：分别进样10μL各标准使用液，并记录相应的面积值，以L-抗坏血酸浓度值为横坐标，面积值为纵坐标，绘制标准曲线。

4.4.3 色谱条件

       （1）色谱柱：Kromasil 100A C₁₈，250mm×4.6mm，5μm

       （2）流动相：0.1%草酸。

       （3）流速：1.0mL/min。

       （4）检测波长：254m。

       （5）进样量：10μL。

4.5 结果计算

      X= （c×V×100）/(m×1000000)

式中  X—样品中维生素C含量[g/100g(mL)]；

           c—从标准曲线查得样液维生素C的质量（μg）；

           V—样品稀释定容体积（mL）；

           m—样品质量（g）；

1000000—μg换算成g的换算系数。