1   钙的测定

样品制备和检测（一式两份）：

收集不少于20袋本品，精密称定，计算每袋平均重量。精密称取相当于碳酸钙约200 mg（大约266mg粉末），转移至适当的瓷坩埚，在800 ± 25° C 下灼烧2个小时。冷却，边搅拌边加10ml水，随后向坩埚中滴加2mL的3N盐酸使残渣溶解，加热坩埚，使残渣完全溶解。用水将该溶液移至250ml烧杯中，用水稀释至150ml，加15mL的1N氢氧化钠溶液，加羟萘酚蓝指示剂少许，用0.05mol/L乙二胺四醋酸二钠（EDTA）滴定，溶液变为深蓝色。每毫升0.05mol/L乙二胺四醋酸二钠滴定液（EDTA ）相当于5.004mg 的碳酸钙。

计算公式：

钙含量(mg/袋)   

其中 AWD为样品的平均重量（mg）

40.078 和100.09分别为钙和碳酸钙的相对原子质量和相对分子质量。

2   维生素D的测定

注意：由于维生素D  ₃对光敏感，对照品溶液及供试品溶液制备过程中，需使用棕色玻璃器皿或者使用透明容器时用铝箔包裹。

二甲基亚砜溶液的制备   :

二甲基亚砜与水2：10混合，冷却至室温。

溶剂溶液的制备：

精密称取800mg丁羟甲苯加入到4L二甲基亚砜溶液中，得到含0.02% 的丁羟甲苯的二甲基亚砜溶液。

正己烷提取液的制备   :

精密称取丁羟甲苯800mg加入到4L正己烷溶解，得到含0.02% 的丁羟甲苯的正己烷溶液。

流动相的制备   :

色谱纯级正己烷与色谱纯级异丙醇按99：1混合均匀。

系统适应性溶液的制备：

取浓度为1μg/mL 维生素D₃工作 对照品溶液10 mL在60℃水浴中加热1小时后，放冷至室温，使维生素D ₃ 部分异构化成相应的前体。

对照品溶液的制备（一式两份，一份为工作对照品溶液，一份为工作检测对照品溶液）：

精密称取维生素D ₃对照品25.0mg于100mL棕色容量瓶中, 加入75ml正己烷提取液，超声溶解15分钟，并时时振摇至完全溶解，保持超声水温不超过30°C。从超声仪中取出，加入正己烷提取液稀释至刻度，摇匀，此为维生素D ₃对照品贮备液1，维生素D ₃浓度为250ug/ml 。用移液管精密吸取5.0 mL维生素D ₃对照品贮备液1，置50 mL棕色容量瓶中，用正己烷提取液稀释至刻度，此为对照品贮备液2，维生素D ₃浓度为25ug/ml。再用移液管精密吸取2.0 mL 维生素D ₃对照贮备液2，置50 mL棕色容量瓶中,     加入正己烷提取液稀释至刻度，制成每1 mL中含维生素约D ₃ 约1ug对照品溶液。

供试品溶液制备（一式两份）

取本品25袋内容物，精密称定，计算每袋平均重。混合均匀，无需研细，使用凹槽较深的药匙取样，取样时不要抖落样品，精密称取7.1± 0.7g( 约相当于维生素D  ₃ 25 µg）置于100mL棕色容量瓶中，加溶剂溶液 50mL，超声震荡15分钟，并时时振摇，保持超声水温不超过 30°C，精密加入正己烷提取液25    mL，振摇 15分钟，离心5分钟（4000转 /分钟），取上清溶液，转移至另一个棕色容量瓶中，避光静置1小时后的澄清溶液作为供试品溶液。

色谱系统：

有UV或 PDA检测器的   Waters    HPLC    系统，或相似系统。

色谱条件：

流速：1.5mL/min

波长：265nm

HPLC   色谱柱： Waters   NH2 250mm× 4.6mm    或类似色谱

柱温： 室温

进样量：100ul

系统适应性：

注射至少1 针提取液，确认提取液对维生素D ₃峰无影响。

注射1针系统适应性溶液， 5针工作对照品溶液和3针工作检测对照品溶液。系统适应性要求如下（包括工作对照品比对）：

分离度： 不小于 5

拖尾因子：不大于2.0

标准比较因子：不小于 0.98  且不大于1.02

理论塔板数：不小于5000

如果符合系统适应性要求，注射供试品溶液各2针。

每20    针或每不少于4小时样品运行注射工作对照品溶液，所有的样品需要被工作对照品溶液包围。所有进样标准品的 RSD% 应不大于2%   。

计算公式：

维生素D含量(μg / 袋 )

其中：Ru:为供试品溶液的平均峰面积

RS:  为5针维生素D ₃ 工作对照品溶液的平均峰面积；

P ：为维生素D ₃ 对照品纯度；

Std.Wt ：为维生素 D ₃ 对照品的重量， mg   ；

Spl.Wt ：为样品重量， mg   ；

AWD   ：为 25 袋单位剂量的平均重量，mg   ；

 “1.09”   为维生素 D的校正因子。

应符合《中华人民共和国药典》中“制剂通则”项下颗粒剂的规定。